RhoA e RhoC são Rho GTPases reguladoras da proliferação e morte celular. Estas pequenas proteínas parecem atuar na promoção do desenvolvimento tumoral, porém suas funções em células leucêmicas foram pouco exploradas. Neste estudo, avaliamos os efeitos do silenciamento de RhoA e RhoC nas funções de células mieloides e resposta terapêutica in vitro.

A linhagem celular leucêmica mieloide U937 foi silenciada para RhoA (shRhoA) ou RhoC (shRhoC) com lentivírus. As células silenciadas foram tratadas ou não com quimioterápicos. A morfologia celular foi avaliada por microscopia de contraste de fase e microscopia confocal (marcação com faloidina e tubulina). A viabilidade celular foi avaliada através do ensaio MTT. O ciclo celular, a apoptose (marcação com anexina-V e PI) e a ativação de vias de reparo ao DNA (marcação com p-γH2AX) foram analisados por citometria de fluxo. A efetividade do silenciamento gênico e a expressão de proteínas de reparo do DNA foram avaliadas por Western Blotting.

O silenciamento gênico de RhoA ou RhoC induziu alterações morfológicas nas células U937. Nas células shRhoA, observamos contorno citoplasmático irregular e presença de longas projeções de actina, já nas células shRhoC observamos uma morfologia mais arredondada e presença de projeções de actina mais curtas e uniformes, enquanto as células controle (shCTRL) exibiram morfologia arredondada e uniforme, e ausência de projeções citoplasmáticas. O silenciamento de RhoA aumentou a apoptose em 17% e induziu acúmulo de células na fase G2/M do ciclo celular (14%), além de aumentar a expressão de p-γH2AX. Estes resultados estão de acordo com a diminuição da expressão de p-CHK2 observada nas células shRhoA. Interessantemente, 13% das células shRhoA apresentaram-se com dois ou mais núcleos, enquanto apenas 3% de células shRhoC e 1% das células shCTRL apresentaram mais de um núcleo. Ao contrário das células shRhoA, as células shRhoC não apresentaram alteração na apoptose, na expressão de p-γH2AX ou no ciclo celular. As concentrações de 100nM de citarabina e 5nM de daunorrubicina (abaixo do IC50) foram escolhidas a partir dos testes de viabilidade com as células U937 parentais. A apoptose e a ativação das vias de reparo do DNA foram potencializadas nas células shRhoA, com aumento de 26% no tratamento com citarabina e 7% com daunorrubicina. Estes mesmos efeitos não foram observados nas células shRhoC.

RhoA e RhoC são genes homólogos envolvidos na progressão do câncer. Porém, parecem ter diferentes funções em células leucêmicas, pois as diferenças fenotípicas entre shRhoA e shRhoC sugerem que os agentes responsáveis pela regulação do citoesqueleto são diferentes. Adicionalmente, RhoA parece atuar na resistência à quimioterapia, pois seu silenciamento gênico foi capaz de intensificar a ação da citarabina, um fármaco altamente utilizado na prática clínica no tratamento de LMA.

RhoA parece influenciar diretamente a progressão do ciclo celular e reparo a danos ao DNA e sua inibição potencializa os efeitos dos tratamentos com citarabina e daunorrubicina na indução da apoptose in vitro. RhoC deve participar da manutenção da morfologia de células leucêmicas e seu silenciamento parece não alterar a reposta a quimioterápicos in vitro.

CAPES e FAPESP.