A descoberta do DNA fetal livre na circulação materna, possibilitou o desenvolvimento de ensaios de genotipagem PCR em tempo real não invasiva para detectar o status RHD do feto em gestantes RHD negativas. Essa técnica apresenta maior rapidez, menor risco de contaminação e melhor precisão na tipagem RHD fetal, evitando a administração desnecessária da imunoglobulina profilática em mulheres portadoras de fetos RHD negativos que não apresentam risco de DHRN. É previsível a ocorrência de resultados inconclusivos, devido a fatores como baixa concentração do DNA fetal em plasma materno, presença de variantes de RHD materna e/ou fetal, contaminação, falhas técnicas ou erros de interpretação.

Nosso objetivo foi analisar os resultados inconclusivos ao longo de seis anos, buscando ferramentas para aumentar a sensibilidade e a especificidade da técnica mitigando assim os fatores que contribuem para resultados inconclusivos.

Um total de 296 amostras de gestantes, com idades gestacionais variando de 8 a 32 semanas (média = 18,54), foram analisadas no período de Jan/19 a Jul/25. A extração do DNA fetal foi realizada utilizando o kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit. Para a detecção do gene RHD fetal, foram utilizados primers e sondas específicos para os éxons 5, 7 e pseudogene RHDΨ, além do controle interno (gene CCR5), nos casos duvidosos foram utilizados primers para o exon 10. Em 2024, a técnica foi submetida a uma repadronização, utilizou-se um DNA sintético de concentração conhecida, submetido a diluições seriadas em escala logarítmica (log₁₀) para cada concentração de primers testada. As reações de PCR em tempo real foram realizadas em triplicata, com as concentrações de primers de 600 nM, 400 nM e 200 nM para cada alvo da reação.

A tipagem RhD deduzida do genótipo RhD fetal foi: RHD+ (n=212/72%); RHD- (n = 52/17%). Resultados inconclusivos (n = 32/11%) foram observados em mulheres com idade gestacional entre 10 a 27 semanas (média = 18,19), nos casos de gestação inferior a 20 semanas foi recomendada a recoleta para resultados D-negativos e inconclusivos. A distribuição dos casos inconclusivos foram: em 2022, 6 casos (2,03%); em 2023, 6 casos (2,03%); em 2024, 15 casos (5,07%); e, em 2025, até o mês de julho, 1 caso (0,34%). A revalidação dos primers na concentração de 200nM mostrou eficiência de 100%, indicando o melhor desempenho da amplificação do gene RHD sob essa condição. Nas discrepâncias entre os exon 5 e 7, o exon 10 apresentou resultado negativo e esses resultados foram reproduzidos mesmo com nova amostra.

A taxa de resultados inconclusivos foi de 5,07% (2024). Após a otimização da reação, essa taxa foi reduzida para 0,34%. É possível que o excesso de primers e sondas favoreça ligações inespecíficas em regiões com alta similaridade ao alvo, comprometendo a especificidade da reação e contribuindo para resultados inconclusivos. Acreditamos que essas amplificações inespecíficas estejam relacionadas ao gene RHCE, cuja sequência apresenta aproximadamente 98% de homologia com o gene RHD. Não podemos excluir variantes de RHD no DNA fetal nos casos em que apenas um dos éxons é positivo, seria necessário obter o resultado da tipagem dos recém-nascidos após o nascimento. A otimização das condições da reação de PCR em tempo real, por meio do ajuste das concentrações de primers, resultou no aumento expressivo da eficiência e especificidade do teste para detecção do gene RHD fetal em sangue materno.