O antígeno RhD (RH:1) é o mais importante dentro do sistema RH (004), podendo levar a aloimunização por transfusão sanguínea ou gestação. As hemácias da maioria das pessoas tipadas como D-positivas apresentam aglutinação de 4+ com anti-Ds comerciais. Porém, existe uma grande variabilidade de reatividades com clones de anti-Ds que indicam a presença de variantes no gene RHD, seja pela fraca reatividade ou devido a discrepâncias entre os resultados com esses antissoros. Intensidades de aglutinação (< 2+) indicam variantes D Fraco ou D Parcial, já as intensidades de (3+), podem gerar dúvidas entre D positivo ou variante RHD.

O objetivo desse trabalho foi identificar os polimorfismos mais frequentes do gene RHD em uma coorte de indivíduos que apresentaram reatividade de (3+) na tipagem RhD.

Um total de 29 amostras de pacientes e doadores com aglutinação (3+/3+ ou 3+/4+) foram testados pela técnica do Gel (DG Gel ABO/Rh(2D), Grifols) e com painel de anti-Ds IgM e/ou IgG Monoclonais (Clones MS 201, MS-26, ESD1, D175+D415, NaTH119+LOR-15C9) em Gel e tubo. A Citometria de Fluxo (DxFlex, Beckman Coulter) permitiu a análise da densidade antigênica dessas amostras. As amostras foram fenotipadas para os antígenos C,c,E,e (DG Gel Rh Pheno+Kell, Grifols). A análise molecular foi realizada por PCR-Multiplex e PCR-RFLP para identificar mutações nos éxons 3 a 9 do gene RHD e uma amostra foi analisada pelo Sequenciamento de Sanger.

Das 29 amostras, 16 (55,17%) apresentaram o alelo RHCE*ce e 13 (44,82%) o alelo RHCE*Ce. O clone MS-26 do painel de anti-D mostrou reatividade reduzida (≤ 2+) em 86,2% das amostras, outros clones apresentaram reatividades entre 3+/4+ em 100% das amostras. A densidade antigênica variou de 2.018 a 20.355 antígenos/hemácia. A genotipagem por PCR multiplex/PCR-RFLP identificou até o momento variantes alélicas em 75,86% das amostras das quais as mais frequentes foram (n = 7) RHD*DAR/RH*D; (n = 1) RHD*DAR/RH*DAU; (n = 1) RHD*DAU/RH*DAU; (n = 1) RHD*DAU/RH*D; (n = 1) RH*DAR3.1/DIII.6; (n=9) RHD variantes foram identificadas pelas técnicas de PCR-multiplex e (n = 7) demonstraram RH*D normal para os SNVS analisados.

A escolha de uma bolsa de sangue para a prova de compatibilidade em pacientes com forte aglutinação (>3+) na tipagem RhD, pode induzir a transfusão de sangue RHD+, quando na verdade vimos uma alta frequência de alelos RHD*DAR e RHD*DAU presentes nessas amostras que reforça a transfusão de sangue RHD-. As amostras RHD variantes necessitam do Sequenciamento para a caracterização do Cluster a qual pertencem, assim como, amostras com haplótipos em heterozigose. No nosso estudo, um único paciente com variante de RHD, recebeu transfusões de sangue RHD+ e não desenvolveu anti-D, e uma paciente puérpera com genótipo RH*DAR3.1/DIII.06 e teve indicação de receber a imunoglobulina anti-D profilática. Em doadores, a presença de Variantes RHD não chega ser um problema, apenas indica que a tipagem deve ser considerada como RHD+.Esse estudo mostra a importância de elaborarmos protocolos dirigidos para a investigação molecular em pacientes com fortes aglutinações nos testes sorológicos e assim, proporcionar o manejo transfusional mais adequado para prevenir a aloimunização nesses pacientes, gerenciamento do estoque de sangue RHD- e a administração da Imunoglobulina profilática em gestantes com fenótipo D parcial.