Os receptores de antígenos quiméricos (CARs) convencionais podem reconhecer apenas antígenos de superfície celular em sua conformação nativa. Isso limita o número de alvos moleculares, pois a maioria dos antígenos associados a tumores são intracelulares. O uso de linfócitos T expressando receptores de células T (TCRs) nativos contra antígenos intracelulares é limitado pela baixa afinidade de TCRs naturais, e o aumento artificial na afinidade de TCR pode resultar em reconhecimento cruzado de antígenos próprios. Neste trabalho, relatamos o desenvolvimento de células CAR-T expressando um novo CAR capaz de reconhecer o antígeno intracelular associado ao tumor MAGE-A4 apresentado pelas moléculas HLA-A*02, que é o sorotipo mais frequente no mundo ocidental. MAGE-A4 é um antígeno câncer/testículo expresso por diferentes neoplasias, como mieloma múltiplo (MM), melanoma e outros.

Construímos um vetor lentiviral de terceira geração que codifica o CAR anti-MAGE-A4:HLA-A*02 (pLV-EF1a-MAGEA4_CAR) por clonagem molecular. Em seguida, o vetor foi transfectado em células Lenti-X 293T com dois outros vetores acessórios para produção das partículas virais. Em seguida, os vírus foram usados na transdução de linfócitos T humanos. Para a avaliação da atividade citotóxica e especificidade, as células CAR-T resultantes foram cocultivadas com as linhagens U266 (mieloma múltiplo, MAGE-A4+) e HCT116 (carcinoma colorretal, MAGE-A4-) previamente modificadas para expressar luciferase. O cocultivo foi realizado nas proporções 1:1 e 1:2 (células-alvo: células CAR-T).

Obtivemos sucesso na construção e clonagem do vetor pLV-EF1a-MAGEA4_CAR. A transfecção para montagem do vírus em células Lenti-X também ocorreu corretamente, resultando em um título viral de 8,7 × 106 UI/mL. Após a transdução lentiviral, as células CAR-T foram cultivadas por 15 dias e constatamos que não houve alterações no crescimento, viabilidade e níveis de expressão do CAR. Durante o cocultivo com células tumorais, as células CAR-T anti-MAGE-A4 lisaram 50% e 20% das células U266 nas proporções 1:1 e 1:2, respectivamente. Ao contrário, as células HCT116 não foram lisadas, confirmando a citotoxicidade e especificidade das células CAR-T anti-MAGE-A4.

Estudos já demonstraram a eficácia TCR artificiais contra MAGE-A4. No entanto, o uso de TCRs artificiais é limitado devido ao risco de recombinação com as cadeias do TCR nativo. Ainda, o aumento artificial na afinidade de TCR pode resultar em reconhecimento cruzado de antígenos próprios. Nosso estudo é o primeiro a demonstrar a eficácia de um CAR contra um antígeno intracelular (MAGE-A4) em modelo de MM.

Demonstramos a geração de um novo vetor lentiviral que codifica um CAR totalmente funcional capaz de redirecionar a atividade citotóxica de células T contra células de MM MAGE-A4+HLA-A*02+. Esses resultados estabelecem as bases para o desenvolvimento de uma nova terapia celular avançada contra o MM e outras neoplasias MAGE-A4+.