Avaliar a quantificação de armadilhas extracelulares de neutrófilos, TLR2 e TLR4 em crianças com doença falciforme, após estímulo com PMA.

Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Triângulo Mineiro (CEP – HC UFTM). O grupo de estudo foi composto por 25 crianças com idades de 1 a 13 anos, diagnosticadas com doença falciforme, atendidas no Ambulatório de Hematologia e Hemoterapia do Hemocentro Regional de Uberaba/MG. Foi coletado sangue periférico, por venopunção, em tubos contendo heparina. O isolamento de neutrófilos foi realizado por meio de centrifugação em gradiente de concentração por Ficoll-Paque™. Os neutrófilos isolados foram mantidos por 4 horas em incubadora úmida a 37°C em meio RPMI-1640 contendo 10% de soro fetal bovino, com e sem estímulo por PMA (phorbol myristate acetate). Posteriormente, as amostras foram marcadas com Sytox Green e CD66a para quantificação da netose; CD66a e marcador TLR2 para quantificar o receptor TLR2 e CD66a e marcador TLR4 para quantificar o receptor TLR4. As quantificações da netose e dos receptores foram realizadas por citometria de fluxo em citômetro FACSCanto II. A análise estatística foi realizada utilizando o programa GraphPad Prism e a significância estatística foi definida como p < 0,05.

O estudo foi composto por 13 (52%) crianças do sexo masculino e 12 (48%) feminino, com mediana de idade de 7 anos (1 – 13). Em relação aos genótipos

11 (44%) crianças apresentavam genótipo HbSS, 10 (40%) genótipo HbSC e 4 (16%) outros genótipos. Houve diferença estatística (p = 0,0001) na avaliação da netose, sendo observada maior expressão no grupo de amostras tratadas com PMA em relação ao grupo de amostras não tratadas. Houve diferença estatística (p = 0,0015) na quantificação do receptor TLR2, sendo observada maior quantidade desse receptor no grupo de amostras tratadas com PMA em relação ao grupo de amostras não tratadas. Houve diferença estatística (p = 0,002) na quantificação do receptor TLR4, sendo observada maior quantidade de receptor TLR4 no grupo de amostras tratadas em relação ao grupo de amostras não tratadas.

A doença falciforme é um distúrbio hematológico caracterizado por um processo inflamatório crônico. Tem sido demonstrado que a adesão de células falciformes e neutrófilos ao endotélio colaboram com a vaso-oclusão observada em indivíduos com a doença. Estudos apontam que a alta atividade dos neutrófilos em processos infecciosos nestes pacientes, induz a formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETS), influenciando na iniciação e evolução de trombos, bem como a ativação de TLR2 e TLR4. A ativação desses dois receptores é capaz de produzir citocinas e moléculas de adesão importantes na inflamação, mas que de maneira exacerbada podem levar a vaso-oclusão. No presente estudo, foi observada maior expressão de netose, TLR2 e TLR4 nas amostras estimuladas pelo PMA. A literatura relata que o PMA induz notavelmente vias semelhantes a outros estímulos, sendo considerado um bom estímulo artificial para estudos com neutrófilos, conforme demonstrado no presente estudo.

Os resultados desse estudo sugerem que o PMA é eficaz no papel de estimulador de netose, TLR2 e TLR4.