A Medula Óssea (MO) possui uma complexa rede de interações, formadas por células, matriz extracelular, moléculas e Vesículas Extracelulares (VEs). As VEs são naturalmente liberadas pelas células, transportam moléculas e promovem a comunicação a níveis locais e sistêmicos, sendo sua composição refletida nas células secretoras, implicando em papéis fisiológicos e patológicos. Diante disso, o objetivo deste estudo foi isolar e caracterizar as VEs da medula óssea de crianças com leucemia linfoide aguda.

Esse estudo foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa, CAE: 83186017600005190. Isolamento: As 4 amostras do estroma medular foram obtidas por gradiente de densidade Ficoll-Hystopaque, submetidas a centrifugações crescentes, iniciando com 1.500×g por 10min a 4°C, diluídas com tampão PBS1× (1:1), seguido de centrifugação a 2.000×g por 30 min, 4°C, e 12.000×g por 45 min, 4°C e ao gradiente de sacarose a 30% através da ultracentrifugação a 110.000×g por 1 hora e 50 min, 4°C. Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET): O ultra centrifugado foi submetido a contrastação negativa, fixado com glutaraldeído a 2,5% e corado com solução filtrada de 2% de acetato de uranila e analisado no microscópio eletrônico de transmissão a 120 kV. Espalhamento de Luz Dinâmico (DLS): O ultra centrifugado foi diluído de 1/10, e avaliado quanto ao seu Diâmetro, Índice de Dispersão (PDI) e Potencial Zeta (PZ), mensurado em triplicata e temperatura ambiente, através do Zetasizer Nano, Malvern Panalytical. Nanocitometria de fluxo: O ultra centrifugado foi marcado com os anticorpos monoclonais, anti-anexina, anti-CD9, anti-CD41 e anti-CD235a (Becton Dickinson) e avaliado através dos parâmetros de alta resolução para nanocitometria de fluxo no DxFLEX-Beckman Coulter Life Sciences.

A MET revelou um concentrado heterogêneo, com pequenas VEs (< 200 nm) e VEs médios/grandes (> 200 nm), além de aglomerados proteicos. O DLS revelou um PDI de 0,212 e PZ de -4,00. O diâmetro das VEs variaram entre 78 nm e 800 nm, sendo 30,5% pequenas VEs, 63% VEs médias, e 6,5% maiores que 500 nm. Na nanocitometria nossos achados foram, 25,9% de VEs menores que 200 nm e 7,4% de VEs maiores que 200 nm. Além disso, as VEs apresentaram positividade para Anexina e para a proteína CD9 e negativas para o CD41 e o CD235a.

A heterogeneidade celular na MO espelha o concentrado heterogêneo de VEs, cuja morfologia e contrastação negativa mostraram as pequenas VEs semelhantes a bolhas esféricas, sugestiva de origem exossomal/endocítica e as VEs médias/grandes compatíveis a derivação de brotamento da membrana plasmática. Sendo a estabilidade desse concentrado confirmado pela DLS. Para a nanocitometria a positividade para Anexina amplifica sua origem celular assim como a positividade para o CD9, associado a membrana plasmática ou endossomo, no mais, o ultra centrifugado foi negativo para CD41 e CD235a, marcadores de plaquetas, sugerindo ausência de contaminação.

O método descrito neste estudo permite o isolamento adequado de VEs dos demais constituintes do estroma medular e a sua caracterização, possibilitando sua aplicação em futuros estudos relacionados a sua composição, carreamento e função e implicação na fixação das células leucêmicas e desfecho da doença.