Devido à ausência de estudos sobre o melhor gene de referência para a análise de pacientes com leucemia aguda, o objetivo deste estudo foi realizar uma validação e uma normalização dos ensaios de expressão com amostras de sangue periférico e medula óssea desses pacientes. Metodologia: Um painel de genes comumente utilizados como endógenos foi selecionado da literatura para análise da estabilidade: GAPDH, ABL, HPRT1, RPLP0, ACTB e TBP. O estudo incluiu amostras de medula óssea e sangue periférico de 50 pacientes adultos (25 com diagnóstico de Leucemia Linfoblástica Aguda- LLA e 25 com Leucemia Mieloide Aguda- LMA) e amostras de sangue periférico de 25 pacientes pediátricos com LLA. Além disso, amostras de sangue periférico de 15 voluntários saudáveis foram usadas como controles. Este estudo foi aprovado pelos Comitês de Ética do Hospital Ophir Loyola (nº2.798.615) e do Hospital Geral de Fortaleza (nº4.798.575). Reações em cadeia da polimerase foram utilizadas para identificar diferentes expressões endógenas. A estabilidade dos genes de referência candidatos foi analisada de acordo com três métodos estatísticos de avaliação: NormFinder, GeNorm e R software.

A análise realizada neste estudo mostrou que os genes GAPDH e HPRT não podem ser classificados como bons genes de referência, uma vez que apresentaram alto desvio padrão e grande variabilidade entre os grupos, indicando baixa estabilidade. Além disso, foi possível identificar que o conjunto endógeno composto por ACTB, ABL, TBP e RPLPO apresentou, em geral, bons desempenhos e expressões estáveis entre os grupos analisados. Os níveis de expressão de muitos desses genes apresentam certa variabilidade não apenas dentro dos conjuntos de dados, mas também em relação à origem das amostras analisadas.

Apesar dos genes de referência mais utilizados para estudos de expressão gênica em geral serem os genes B-actina (ACTB), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) e hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase 1 (HPRT1), os resultados de estudos de validação de endógenos são conflitantes. Os achados deste estudo concordam com vários outros estudos que examinaram a estabilidade dos genes de referência GAPDH e HPRT1, demonstrando que eles devem ser utilizados com cautela, devido à considerável variação das expressões. O gene de referência ACTB está diferencialmente expresso em diversos tipos de câncer, o que sugere que sua utilização em estudos de análise de expressão pode ser inadequada. Entretanto, os achados desse trabalho demonstraram que a ACTB foi um dos genes de referência pesquisados com maiores taxas de estabilidade e melhor desempenho de forma geral. Porém os níveis de estabilidades observados nos genes de referência ABL, TBP e RPLPO também foram muito satisfatórios, especialmente quando ambos os tipos de amostra eram analisados de forma conjunta.

Diante desses achados, este estudo sugere que o principal conjunto endógeno para uso como controle/referência em análises de expressão gênica em amostras de sangue periférico e medula óssea de pacientes com leucemias agudas, é composto pelos genes ACTB, ABL, TBP e RPLPO. Além disso, é extremamente necessária a validação de genes de referência para qualquer estudo de expressão gênica, considerando que o endógeno utilizado influencia na confiabilidade e acurácia desses estudos.