A Leucemia Linfoide Aguda (LLA) é o câncer mais comum na infância, representando 25% dos casos. Apesar da alta taxa de cura em países desenvolvidos, cerca de 20% dos pacientes recaem a doença, sendo essa a causa mais comum de morte relacionada ao câncer em crianças. O tratamento nos casos de recaída permanece um desafio e, atualmente, é baseado na quimioterapia convencional e/ou transplante de medula óssea. Entretanto, a LLA é uma doença heterogênea, tanto do ponto de vista genético quanto de resposta farmacológica. Assim, é possível que uma abordagem terapêutica personalizada seja vantajosa. Logo, o objetivo do trabalho foi estabelecer um método de triagem ex vivo de fármacos contra LLA pediátrica de mal prognóstico. Para isso, padronizamos um sistema de co-cultura de células primárias de LLA e células do estroma da medula óssea, semeadas entre uma matriz colágena, em placas de 384 poços. Utilizando esse sistema, é possível triar diversos fármacos de uma única vez. Após a adição de drogas, a placa é submetida a microscopia de campo claro, onde cada poço é fotografado a cada 30 min durante 96h. Ao final, as milhares de imagens geradas são analisadas por um software capaz de discriminar células vivas das mortas de acordo com o perfil de movimentação da membrana das LLA. Células vivas movimentam sua membrana, mas, quando morrem, o movimento cessa, portanto, utilizando esse sistema, é possível detectar o momento da morte celular na presença dos fármacos, e esse é o diferencial do método, uma vez que a maioria dos testes de viabilidade celular são destrutivos, e, portanto, limitados a determinados pontos do tempo, não fornecendo informações sobre a dinâmica temporal da ação das drogas sobre as células malignas. Após padronizarmos essa técnica, a qual nomeamos de ELDA (Ex vivo Leukemia Drug Advisor), validamos o método de discriminação das células vivas pelo ELDA em relação a metodologias ortogonais com uso de marcadores fluorescentes de células vivas (calceina AM), e encontramos forte correlação (r = 0,9). Para avaliar a reprodutibilidade, testamos uma mesma amostra de LLA duas vezes independentes, e obtivemos resultados semelhantes (r = 0,93). A análise de 10 diferentes LLA pediátricas de mal prognóstico, revelou diferenças significativas de perfil de sensibilidade/resistência a um painel de 50 drogas, mesmo entre amostras com um mesmo marcador genético, evidenciando a importância da abordagem personalizada. Por fim, encontramos alta sensibilidade ao inibidor de BCL-2 Venetoclax em amostra de um paciente lactente LLA-B KMT2A:AFF1+ que recaiu duas vezes utilizando terapia padrão. O Venetoclax já foi associado ao subtipo KMT2A:AFF1 na literatura e está em fase de teste clínico para leucemia pediátrica, logo, esse paciente poderia se beneficiar do fármaco encontrado pelo ELDA. Em suma, esse novo sistema de triagem de fármacos baseado na reposta das células dos pacientes é capaz de identificar fármacos ainda não explorados no tratamento convencional da LLA pediátrica, podendo auxiliar na identificação de opções terapêutica em casos de recaída e contribuir com testes pré-clínicos de novas drogas.