Hibridação in situ por fluorescência (FISH) é metodologia amplamente utilizada na rotina citogenética em neoplasias. Sondas comerciais, construídas para detectar rearranjos gênicos (sondas de dupla fusão, sondas de ruptura), ganho e perda no número de cópias, auxiliam no diagnóstico e classificação de várias neoplasias hematológicas. A determinação dos valores de referência (VR) de cada sonda e em cada material é fundamental, sendo sugerido por consensos internacionais o uso de 20 amostras consideradas normais, o que pode ser bastante difícil e necessitar de validação “on going”. O objetivo deste trabalho é comparar o resultado do VR obtido utilizando 5 e 20 amostras.

Amostras de medula óssea foram processadas segundo procedimento operacional do laboratório de forma habitual e analisadas por dois analistas experientes contando 50 células cada, totalizando 100 núcleos por amostra. Foram analisadas sondas das marcas Cytocell e MetaSystems com construção de dupla fusão e duas cores (BCR/ABL1, CCND1/IGH, PML/RARA e CBFB-MHY11), sondas de ruptura (PDGFRA, MYC, KMT2A, TLX1, MECOM) e sondas para deleção e ganho com duas ou três cores (5q, 7q, CDKN2A, TP53), segundo normas do fabricante. A leitura foi realizada em microscópio de fluorescência Axio Imager 2 (Zeiss) com filtros de emissão simples e triplo e captura das imagens realizada no software Isis (MetaSystems). Para determinar o VR foram utilizadas 5 amostras de medula óssea (MO) verdadeiramente negativas e 20 amostras de MO negativos da rotina, utilizando a fórmula BETA.ACUM.INV do EXCEL (probabilidade em decimal; alfa = 1 + maior número de sinais positivos encontrados na leitura, beta = número de células analisadas, A e B em branco) com intervalo de confiança de 95%.

Os VR obtidos utilizando 5 e 20 casos foram respectivamente: para sondas de ruptura PDGFRA 1F1G (4.6%/4.6%) , MYC (4.6%/4.6%), KMT2A (4.6%/4.6%) e TLX1 (6.0%/7.3%); sondas de fusão BCR/ABL1(2.9%/2.9%), CCND1/IGH(2.9%/2.9%), PML/RARA (2.9%/2.9%), CBFB(2.9%/2.9%), MECOM(6.0%/6.0%) sondas de deleção 5q (6.0%/6.0%), 7q(4.6%/4.6%), CDKN2A(4.6%/6.0%), TP53 (7.3%/8.5%).

A determinação do VR em 13 diferentes sondas utilizando 5 e 20 controles normais não mostrou diferença, sugerindo que consensos nacionais e internacionais para procedimentos técnicos e de validação em FISH, como o do American College of Medical Genetics, mereçam revisão.

Não foi observada diferença no VR entre os grupos de sinais para todas as sondas, sugerindo que 5 amostras normais é suficiente para determinação de VR a ser utilizado em rotina diagnóstica.