Avaliar impacto da análise prospectiva da Doença Residual Mínima (DRM) por sequenciamento gênico (Next Generation Sequencing, NGS), no Dia 33 (D33) e Semana 12 (S12) do tratamento, na Sobrevida Livre de Eventos (SLE) da Leucemia Linfoide Aguda (LLA) pediátrica.

De outubro de 2021 a abril de 2023, 146 pacientes consecutivos com LLA de novo, negativa para t(9;22)BCR-ABL1, e idade de 1 a 18 anos, foram tratados de acordo com o protocolo AIEOP BFM ALL 2009 com critérios de risco modificados descritos a seguir. Definição do grupo de Alto Risco (AR): ausência de remissão completa no dia 33 ou KMT2A-AFF1+ ou TCF3-HLF+ ou hipodiploidia ou DRM por Citometria de Fluxo em medula óssea do dia 15 ≥ 10% e não ETV6-RUNX1 ou IKZF1plus e DRM (NGS) em D33 positivo (ou inconclusivo) desde que não seja ETV6-RUNX1+, TCF3-PBX1+ ou KMT2A rearranjado ou DRM em D33 ≥ 5 × 10-4 e S12 positivo, porém < 5 × 10-4 ou DRM em S12 ≥ 5×10-4. Grupo de Baixo Risco (BR) definido como: sem critérios de alto risco e DRM em D33 negativo para todos os marcadores investigados (ao menos um marcador com sensibilidade ≤ 10-4) ou DRM (NGS) em D33 inconclusivo desde que DRM negativa em S12 e D15 (por citometria de fluxo) < 0,1%. Risco Médio (MR): ausência de critérios de AR e sem critérios de BR. Para análise da DRM foram utilizados primers Biomed2 para amplificação dos rearranjos IGH, IGK, IGL, TCRG e TCRD, acrescidos de adaptadores para sequenciamento na plataforma Illumina. Foram utilizados 600 ng de DNA genômico, acrescido de diferentes quantidades de DNA de plasmídeos contendo rearranjos Ig/TCR, para normalização dos resultados. Foram lidos no mínimo 500.000 ‘reads’ por rearranjo, sendo dois os rearranjos analisados por paciente, se disponíveis. Os dados foram analisados na plataforma VidJil.

Remissão citológica foi atingida em 96% (142/146) dos pacientes. Morte durante o período de indução ocorreu em 2 pacientes (1,3%). Análise da DRM por NGS no D33 foi realizada em 137 pacientes (93%), sendo negativo em 80 pacientes (54%) e positivo em 57 (39%) pacientes. A Sobrevida Global e SLE em 1,3 anos dos 146 pacientes foi de 94,2±2,5% e 92,2 ± 2,0%, respectivamente. Pacientes com DRM ≥ 5×10-4 no D33 apresentaram SLE significativamente inferior a pacientes com DRM negativa ou abaixo dessa linha de corte (84,8 ± 5,9% vs. 98,2 ± 1.8%, p < 0,001). Na S12 a diferença entre os grupos foi ainda mais acentuada (SLE: 49,2 ± 1,7% vs. 97,7±1,7%, p < 0,001).

A avaliação da DRM por NGS permite rastrear vários subclones Ig/TCR no mesmo ensaio, prescinde do desenho e seleção de primers paciente-específicos. O custo dos reagentes e plásticos para o NGS é comparável ao qPCR, porém o NGS é mais rápido e demanda menos mão de obra. Dados da literatura mostram que os valores de DRM mensurados por NGS tem alta correlação com dados obtidos por qPCR. O qPCR, entretanto, parece dar mais falsos positivos do que o NGS, especialmente em se tratando de valores muito baixos de DRM (< 5×10-5).

Nossos resultados, embora interinos, mostram que a avaliação prospectiva da DRM pelo sequenciamento gênico é factível e permite identificar grupos de pacientes com SLE significativamente diferente.