A terapia gênica para tratamento da Doença Falciforme (DF) tornou-se uma realidade após aprovação de dois produtos comerciais, pelas agências reguladoras dos EUA (FDA) e União Européia (EMA). Entretanto, essas aprovações revelaram um novo obstáculo para o acesso dos pacientes - o elevado custo. Estimado em $ 3.1 milhões para o Lovotibeglogene autotemcel (Lyfgenia, bluebird bio, Inc, EUA), o produto é inacessível para a maioria dos pacientes, sobretudo em países de média e baixa renda, nos quais a DF é mais prevalente. No Brasil, onde os produtos ainda não estão aprovados, a realidade não é diferente. A disponibilidade desse tratamento, potencialmente curativo, parece depender de iniciativas nacionais que desenvolvam produtos de terapia gênica com custo reduzido.

Com isso, esse projeto desenhou dois vetores lentivirais (Lenti-VP64 e Lenti-VP64+BCL11A) para reativar a expressão do gene endógeno da gama-globina utilizando um ativador transcricional acrescido ou não de um mecanismo de modificação pós-transcricional. Ambos os vetores possuem EGFP como gene repórter.

Foram realizadas a produção das partículas lentivirais e a padronização da transdução de células-tronco e progenitores hematopoiéticos (CD34+) do sangue mobilizado de doadores saudáveis (DS) utilizando 8 diferentes condições de transdução (n = 3) e cinco diferentes multiplicidades de infecção (MOI) (n = 4).

Resultados demonstraram a viabilidade de produção dos dois vetores em altos títulos, utilizando células HEK293T. A transdução de células CD34+ de DS apenas com os vetores (MOI10) resultou em 5,49 % ±1,04 de CD34+GFP+ após 48 horas para o Lenti-VP64 e 7,4 % ± 1,75 para o Lenti-VP64+BCL11A. O uso dos vetores em poços tratados com retronectina elevou a porcentagem de CD34+GFP+ para 19,3 % ± 7,28 com o Lenti- VP64 e 21,0 % ± 8,29 com o Lenti-VP64+BCL11A. A retronectina associada ao sulfato de protamina não se mostrou diferente da condição anterior com 20,3 % ±8,49 de CD34+GFP+ com o Lenti-VP64 e 20,3 % ±7,72 com o Lenti-VP64 + BCL11A. A adição do Poloxamer Synperonic F108 aos vetores e ao sulfato de protamina apresentou a maior porcentagem de células CD34+GFP+ observada para o Lenti-VP64 e o Lenti-VP64 + BCL11A, com 33,20% ± 3,55 e 36,8% ± 5,12, respectivamente. A adição da retronectina à condição anterior não resultou em melhoria na taxa de transdução. Em seguida, foram testados os MOI de 2,5; 5; 10; 20 e 40 de cada vetor em células CD34+ de DS (n = 4). O MOI de 2,5 resultou em 35,45% ± 7,03 para o Lenti-VP64 e 42,7 % ±13,65 o Lenti-VP64+BCL11A. O MOI de 5 elevou a porcentagem de CD34+GFP+ para 54,45 % ±10,81 com o Lenti-VP64 e 54,4 % ±10,92 com o Lenti-VP64+BCL11A. Utilizando o MOI 10 foram obtidas 62,2 % ±8,64 e 64,25 % ±8,92 CD34+GFP+ com os Lenti-VP64 e o Lenti- VP64+BCL11A, respectivamente. Os MOI de 20 e 40 não resultaram em aumento na taxa de transdução quando comparado ao MOI 10. Não foi observada uma intensa redução de viabilidade celular em nenhuma das condições.

Em conclusão, os resultados demonstram que os vetores Lenti-VP64 e Lenti-VP64+BCL11A são capazes de transduzir células CD34+ de DS. A transdução utilizando sulfato de protamina e poloxamer associado aos vetores foi a mais eficiente. O MOI 10 foi capaz de gerar altas porcentagem de células GFP+ e será utilizado nas etapas seguintes do projeto, nas quais analisaremos a capacidade dos transgenes de aumentar a expressão de HbF em células de DS e células de pacientes com DF. FAPESP (2022/07503-7), CTC (2013/08135-2) e CAPES.