Padronizar duas técnicas de PCR multiplex alelo específico (MAS-PCR) que classifiquem ao mesmo tempo os indivíduos CDe como D fraco tipo 3, 11 ou 38 e os indivíduos cDE como D fraco tipo 2 ou 5.

Amostras de 15 indivíduos previamente fenotipados como D-fraco e genotipados por sequenciamento de Sanger, provenientes do banco de amostras da Fundação Pró Sangue – Hemocentro de São Paulo, que apresentavam alelos D-fraco tipo 2, 3, 5, 11 e 38 foram selecionados para padronização. As amostras D-fraco tipo 2 ou 5 eram CDe e amostras D-fraco tipo 3, 11 ou 38 eram cDE. O desempenho do MAS-PCR foi avaliado em comparação com o método de Sanger, caso os resultados obtidos fossem semelhantes entre as técnicas, o teste MAS-PCR seria aprovado.

Todas as 15 amostras apresentaram os genótipos concordantes com os resultados do sequenciamento de Sanger realizado previamente e puderam ser identificadas entre as variantes de RHD testadas. Um controle interno (IC) sem mutações RH e uma amostra em branco foram testados no ensaio MAS-PCR proposto. A precisão do teste foi considerada 100%.

O método de PCR alelo específico (AS-PCR), o teste mais utilizado para genotipagem, permite a identificação de uma variante por vez, enquanto o ensaio de MAS-PCR permite a identificação de mutações simultâneas em uma só reação e mostrou-se bastante eficiente. Com isso, poderíamos ter mais agilidade, economia de material genético e redução de custos. Além disso, para a identificação de mutações RH , o conhecimento dos fenótipos RhCE ajuda a definir qual MAS-PCR usar como estratégia. Se CDe utilizamos MAS-PCR para D-fraco tipo 11, 38 ou 3, enquanto para cDE podemos usar o teste que distingue entre D-fraco tipo 2 ou 5 MAS-PCR. Por fim, o teste MAS-PCR poderia ser utilizado em populações mestiças como a brasileira, pois inclui as principais mutações frequentemente encontradas em nosso país. Com base nos resultados e na estratégia utilizada pelo grupo, foi desenvolvida uma estratégia de investigação para encontrar doadores de sangue D-fraco e D-parcial. Na literatura foram encontradas algumas estratégias que investigam casos semelhantes em uma mesma população, no entanto, os casos demoram mais para serem resolvidos, assim como mais recursos e dinheiro devem ser gastos.

Nosso objetivo era padronizar a técnica de MAS-PCR e garantir que nossos resultados fossem consistentes com uma genotipagem prévia realizada por sequenciamento de Sanger. Um total de 15 amostras foram testadas e todas apresentaram compatibilidade entre as técnicas. Assim, a técnica MAS-PCR mostra-se confiável para ser realizada para solucionar esses casos de forma rápida e eficiente.