
O sistema de grupo sanguíneo Duffy apresenta significado clínico e os anticorpos formados contra seus antígenos estão envolvidos em reações hemolíticas transfusionais e em casos de doença hemolítica do feto e do recém nascido. Os principais antígenos desse sistema são os antígenos Fya e Fyb, codificados pelos alelos co-dominantes FY*A (FY*01 ) e FY*B (FY*02 ), que diferem por um único polimorfismo de nucleotídeo, c.125G>A. Os fenótipos expressos podem ser: Fy(a+b-), Fy(a-b+), Fy(a+b+) e Fy(a-b-). O fenótipo Fy(a-b-) surge da homozigose para um alelo FY*B portador de uma mutação pontual c.-67T > C na região 5’ não traduzida. Essa mutação dá origem ao alelo FY*BES (FY*02N.01 ), que prejudica a atividade do promotor em células eritróides ao interromper um sítio de ligação para o fator de transcrição eritróide GATA. Essa mutação impede a expressão do antígeno Fyb apenas nas hemácias, mas não em outros tecidos. Para a definição correta dos fenótipos Fya e Fyb, a partir da caracterização alélica dos genótipos FY*A e FY*B, a presença da mutação c.-67T>C deve sempre ser investigada.
ObjetivoPadronizar a genotipagem para os alelos FY*A e FY*B e da mutação c.-67T>C por método de PCR em tempo real e elucidar a interpretação dos resultados em amostras de doadores de sangue da Fundação Hemocentro de Brasília.
Materiais e métodosForam selecionadas para o estudo amostras de doadores de sangue previamente fenotipados para os antígenos Fya e Fyb, sendo 10 amostras de cada perfil fenotípico: Fy(a+b-), Fy(a-b+), Fy(a+b+) e Fy(a-b-). O DNA genômico foi extraído utilizando o Kit Biopur, conforme instruções do fabricante. Para a genotipagem, os primers e as sondas foram adquiridos em ensaios customizados, da Thermo Fisher Scientific, rs12075 e rs2814778, os quais detectam os polimorfismos de único nucleotídeo, Duffy (c.125 A>G) e GATA (c.-67T>C), respectivamente. As sondas foram marcadas pelos fluoróforos FAM e VIC para cada alelo. As reações em tempo real foram realizadas usando o QuantStudio™5 Real-Time PCR System, em volume de 10μL. Em cada reação foram adicionados 5μL de TaqPathTM ProAmpTM Master Mix (2X), 0,5 μL de TaqMan®SNP Genotyping Assay (20X), 3,5 μL de água nucleasse free e 1μL de DNA genômico 20ng/μL. As condições de ciclagem para as duas reações foram 40 ciclos de pré-leitura (ruído basal) 60°C por 30 segundo; desnaturação inicial/ativação da enzima 95°C por 5 minutos; desnaturação 95°C por 15 minutos; anelamento/extensão 60°C por 60 segundos e pós-leitura 60°C por 30 segundos.
Resultados e discussãoO resultado de genotipagem do alelo FY*A em homozigoze apresentou 100% de concordância com o fenótipo previamente cadastrado, enquanto que, a genotipagem do alelo FY*B , em homozigoze ou heterozigose, apresentou resultados discrepantes com o fenótipo. Os resultados da genotipagem da mutação c.-67T>C, que caracteriza o alelo FY*BES , demonstrou que em todas as amostras, as quais apresentaram discrepância com o fenótipo, havia a presença da mutação c.-67T>C. A ocorrência dessa mutação interrompe a transcrição do alelo FY*B , e a não expressão do antígeno Fyb nas hemácias, causando a discrepância entre genótipo e fenótipo. Ao ser analisado os dois ensaios em conjunto 06 genótipos puderam ser encontrados: 1. FY*A/FY*A; 2. FY*B/FY*B; 3. FY*A/FY*B; 4. FY*A/FY*BES; 5. FY*B/FY*BES; 6. FY*BES/FY*BES.
ConclusãoO ensaio de genotipagem dos alelos FY*A e FY*B e da mutação FY*BES por PCR em tempo real foram padronizados e, portanto, estão aptos para a realização da validação do método, utilizando amostras com resultados prévios de genotipagem para esses alelos. O uso desse ensaio na rotina laboratorial auxiliará na resolução de casos complexos e no aumento da segurança transfusional.