No contexto da terapia celular, o uso de células estromais mesenquimais multipotentes (MSC) se dá em grande parte pela sua propriedade imunomodulatória. Neste processo, as MSC liberam fatores solúveis que gerenciam a citotoxicidade e proliferação das células do sistema imunológico melhorando o prognóstico de doenças inflamatórias. Entre os principais fatores está a prostaglandina E2 (PGE2), um eicosanoide sintetizado após a estimulação das MSC com a citocina inflamatória TNF-α e o aumento de expressão nas células de ciclo-oxigenase 2 (COX-2). Baseado nisto, propõe-se que moléculas que mimetizam a ação da citocina inflamatória poderiam ser selecionadas como novos moduladores de COX-2 e otimizariam funcionalmente as MSC na terapia. Diante desta hipótese, o objetivo deste trabalho foi realizar um ensaio de qPCR em larga escala para seleção destas novas moléculas. Para o desenvolvimento da abordagem, foi selecionada uma linhagem primária de MSC isolada de cordão umbilical (UC-MSC) com expressão gênica e proteica de COX-2 aumentadas após o tratamento com 100 ng/mL de TNF-α por 72 horas. No ensaio, a cultura de células recebeu os seguintes tratamentos: controle positivo de modulação de COX-2, TNF-α 100 ng/mL; controle negativo, o solvente da coleção de moléculas, DMSO, a 0,5% e, por fim, 715 moléculas, adicionadas poço a poço, com concentração de 50 μM. O período de tratamento foi de 72 horas e, posteriormente, as placas de cultivo seguiram para extração automatizada de RNA total e síntese de cDNA. Para a reação de qPCR, o gene alvo foi PTGS2 (COX-2) e o endógeno, B2M. O método de análise dos dados foi 2−ΔΔCt. Foram feitas duas triagens. As moléculas selecionadas seguiram para ensaio de validação, no qual, a UC-MSC foi tratada com diferentes concentrações da molécula (50 a 0,8 μM) em diluição seriada fator 2. Após período de 72 horas, a proteína total foi extraída de cada tratamento e avaliada por Western Blot (WB) para expressão de COX-2. Os resultados demonstraram que em decorrência de efeitos citotóxicos e baixo rendimento, de 715 tratamentos, 590 foram analisados no qPCR. A triagem primária selecionou 53 alvos e a secundária, duas moléculas: o produto natural indirubina (PubChem: 46386581) e o anti-inflamatório piroxicam (PubChem: 46386918). Resultados preliminares da etapa de validação por WB de um isômero de indirubina (Sigma-Aldrich - PHL89716) mostram que as concentrações 12,5 e 6,2 μM apresentam bandas mais intensas de COX-2 (volume relativo de banda: 0,159 e 0,111, respectivamente) em comparação ao tratamento com solvente DMSO (volume relativo de banda: 0,082). Para o piroxicam (PubChem: 46386918), a expressão positiva para COX-2 foi observada nas concentrações de 50 a 12,5 μM. Não foram analisados os volumes de banda. A conclusão até o momento, é que o ensaio de qPCR em larga escala baseado no eixo TNF-α - COX-2 permitiu a seleção de duas moléculas candidatas a moduladores de COX-2. Para os próximos passos pretende-se repetir a validação por WB, determinar EC50 com base na quantificação de PGE2 em meio condicionado pelas células após o tratamento com diferentes concentrações das moléculas selecionadas e, por fim, elaborar uma abordagem in vitro para avaliar a funcionalidade de UC-MSC previamente tratadas.

CTC-FAPESP:(2013/08135-2); INCTC-CNPq (465539/2014-9); CAPES (88882.378939/2019-1); FUNDHERP).