Desenvolvimento e implementação de teste diagnóstico sensível e custo-efetivo para detecção da variante somática L265P no gene MYD88 pela técnica de PCR digital.

Foi utilizada plataforma de PCR digital da QIAGEN e ensaio TaqMan para a alteração L265P em MYD88. As amostras utilizadas na validação tinham resultado conhecido em teste de referência (sequenciamento SANGER ou de próxima geração - NGS). DNA sintéticos com e sem a variante foram misturados em diferentes proporções e submetidos às reações. O ensaio de PCR digital foi avaliado quanto à linearidade, sensibilidade, reprodutibilidade em 3 frequências alélicas diferentes, limite de detecção (LoD) e limite de branco (LoB). Resultado: O ensaio apresentou robustez e linearidade em todas as faixas de frequência alélica avaliadas. O teste se mostrou sensível, confirmando todas as alterações reportadas em teste de referência, e ainda detectando alterações em baixa frequência alélica (confirmado por método ortogonal) em amostras previamente consideradas selvagens pelo teste referência. A reprodutibilidade teve coeficientes de variação dentro do esperado para cada faixa de frequência alélica tanto com amostras biológicas quanto com DNA sintético. A avaliação de LoB mostrou especificidade e permitiu definir um LoD de 0,5% de frequência alélica da variante L265P.

A detecção da variante MYD88 L265P é importante para o diagnóstico diferencial de Macroglobulinemia de Waldenström (MW) com outros subtipos de linfomas B que apresentam pico monoclonal IgM, ou que apresentam diferenciação plasmocítica. A presença da variante L265P é fortemente favorável ao diagnóstico de MW na presença de características clínicas e histológicas apropriadas. Além disso, a variante L265P serve como um biomarcador para resposta à terapia com inibidores de BTK (tirosina quinase de Bruton). As taxas de resposta para ibrutinibe em pacientes com MW com a variante MYD88 L265P de tipo selvagem são próximas de 100% no cenário de primeira linha de tratamento e acima de 90% no cenário recidivante/refratário. Principalmente por conta do acompanhamento de resposta, a detecção de frequências alélicas baixas por metodologia sensível é de suma importância. A PCR digital traz o benefício da alta sensibilidade comparada a qPCR e custo-efetividade comparada ao NGS. A estratégia se mostrou relevante mesmo em amostras ao diagnóstico, com baixa frequência alélica da variante, pois outras metodologias talvez não fossem capaz de identificar a alteração.

O teste validado tem performance adequada tanto para o diagnóstico diferencial como para o acompanhamento do tratamento com inibidores de BTK e pode ser implementado na rotina de análises clínicas.