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Vol. 46. Núm. S4.
HEMO 2024
Páginas S501-S502 (outubro 2024)
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Páginas S501-S502 (outubro 2024)
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COOPERAÇÃO DAS MUTAÇÕES CALR E TP53 NA TRANSFORMAÇÃO LEUCÊMICA DAS NEOPLASIAS MIELOPROLIFERATIVAS
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S Beneditoa,b,c,d,e,f, P Sabboa,d, B Arkounc,d, M Bonaminoa,b, CM Oiarzunc,d, H Raslovac,d,g, I Antony-Debréc,d,g, I Ploc,d,g, B Monte-Móra,b
a Instituto Nacional de Câncer (INCA), Rio de Janeiro, Brazil
b Programa de Terapia Celular e Gênica, Coordenação de Pesquisa, Instituto Nacional de Câncer (INCA), Rio de Janeiro, Brazil
c Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Unité Mixte de Recherche 1287, Gustave Roussy, Université Paris-Cité, Villejuif, France
d Gustave Roussy, Unité mixte de recherche 1287, Villejuif, France
e Université Paris-Cité, Unité mixte de recherche 1287, Paris, France
f Vice-Presidência de Pesquisa e Coleções Biológicas (VPPCB), Fundação Instituto Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Rio de Janeiro, Brazil
g Université Paris-Saclay, Unité mixte de recherche 1287, Gustave Roussy, Villejuif, France
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Introdução

As Neoplasias Mieloproliferativas (NMPs) são caracterizadas por mutações driver nos genes JAK2, CALR ou MPL que levam à ativação constitutiva do eixo receptor de citocina JAK/STAT e mieloproliferação. A ocorrência de mutações somáticas, perda de heterozigosidade e/ou deleções no gene TP53 está associada a um maior risco de transformação para Leucemia Mieloide Aguda. Os mecanismos celulares e moleculares associados às mutações em TP53 e transformação leucêmica de NMP CALR -mutadas são pouco conhecidos. Nesse trabalho, usamos modelos de células tronco de pluripotência induzida (iPSC) para estudar a cooperação entre as mutações em CALR e TP53 nas NMPs.

Métodos

Linhagens de iPSC de um indivíduo saudável (CALR wt) e de um paciente com NMP (CALR del52) foram editadas em TP53 usando CRISPR/Cas9. Para knockout (KO), foi utilizado um sgRNA específico para o exon 5 que foi clonado em um vetor expressando Cas9 e o marcador GFP. Para knock-in (KI) da mutação R175H, foi utilizado complexo RNP e plasmídeo com sequência doadora e marcador mCherry. Os clones foram triados por PCR e digestão enzimática e a edição foi analisada por sequenciamento. Para avaliar uma possível edição inespecífica, seis regiões potencialmente reconhecidas pelo sgRNA foram sequenciadas. Para verificar a expressão gênica das mutações geradas, o cDNA de TP53 (exons 4-7) foi sequenciado. Para avaliar a função de p53, as iPSCs foram tratadas com nutlina e a expressão da proteína foi analisada por Western Blot e a expressão dos genes alvos por qPCR. Para estudar o impacto das mutações na hematopoiese, foi realizada a diferenciação in vitro, seguida de análise das células hematopoiéticas por citometria de fluxo. Os progenitores hematopoiéticos obtidos foram avaliados em ensaio clonogênico e em cultura líquida, com análise das células hematopoiéticas após 7 dias por imunofenotipagem.

Resultados

A partir de iPSC CALR wt e CALR del52 foram gerados clones com mutações in-frame ou frameshift em TP53 e clones CALR del52TP53 R175H. Mutações in-frame e R175H estavam presentes em cDNA, enquanto as mutações frameshift não foram expressas. Modelos iPSC TP53wt tratados com nutlina mostraram estabilização e fosforilação de p53 e aumento na expressão dos genes alvo. No entanto, a função de p53 foi inibida em iPSCs TP53 -editadas. Inesperadamente, a proteína p53 não foi expressa em células com TP53 R175H resultando em um KO completo. Com relação à hematopoese, a mutação em CALR del52 acarretou o aumento de progenitores megacariocíticos, independentemente da edição de TP53. Nos ensaios clonogênicos, a edição de TP53 foi associada a um maior número de colônias mieloides no contexto CALR wt. Já nas iPSC CALR del52, p53KO levou ao aumento do número de colônias mieloides com presença de colônias CFU-GEMM e aumento do tamanho de colônias megacariocíticas. Além disso, em CALR del52/TP53 -editadas houve maior número de precursores megacariocíticos em cultura líquida, na ausência de trombopoetina.

Conclusão

A cooperação das mutações CALR del52 e TP53 induz a amplificação de progenitores hematopoiéticos imaturos e potencializa a megacariopoiese. A modulação dos efeitos hematopoiéticos está inversamente correlacionada com o grau de inativação do TP53 no contexto CALR del52, com ausência completa de p53 exibindo o fenótipo mais marcado. No geral, nosso trabalho mostrou que a perda da função do p53 contribui para a desregulação da hematopoiese imatura.

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Hematology, Transfusion and Cell Therapy
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