Examinar a atividade da enzima Ectonucleosídeo Trifosfato Difosfohidrolase (E-NTPDase) em concentrados de plaquetas (CP) randômicas contaminados com hemácias (CPRCH).

As plaquetas foram obtidas de CPs contaminados, ou não, e coletadas no dia do processamento (D0) e do descarte (D5). As amostras foram divididas em 4 grupos, Controle (Ctrl; N = 10; sem contaminação), baixa contaminação (BC; N = 10; entre 4,0 × 105 e 7,0 × 105hemácias/mL), média contaminação (MC; N = 13; 7,0 × 105 e 1,2 × 106 hemácias/mL) e alta contaminação (AC; N = 13; acima de 1,2 × 106 hemácias/mL). Alíquotas dos CPRCH sofreram sucessivas centrifugações para retirada das hemácias (tampão hemolítico EDTA/NH4Cl) e para lavagem das plaquetas (tampão Hepes Isosmolar; 3,5 mM; pH 7,2). Após a descontaminação, as plaquetas foram ressuspendidas, congeladas e reunidas para as análises. Para os ensaios de atividade enzimática, as amostras foram descongeladas, lavadas e ressuspendidas em tampão Hepes, tendo teor de proteínas das suspensões ajustado na faixa de 0,4 a 0,6 mg/mL. A atividade da E-NTPDase, avaliada separadamente na hidrólise da adenosina trifosfato (ATP) e da adenosina difosfato (ADP), se deu por análise espectrofotométrica, com emprego de reagente de cor e leitura da reação em 630nm. A atividade foi expressa em nmol de fosfato inorgânico liberado por minuto por miligrama de proteína (nmol Pi/min/mg prot). Na estatística, foi realizada análise de variância com ANOVA de uma via seguida por pós teste de Dunnett, empregando Graph Pad® Prism 5 . O trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética da UFN (parecer 4.972.737).

Para a hidrólise do ATP, as atividades entre os grupos testes BC, MC e AC não diferiram estatisticamente, mas foram maiores (respectivamente 0,0127; 0,0139 e 0,0128 nmol Pi/min/mg; P < 0,001) que as atividades dos controles Ctrl D0 e Ctrl D5 (respectivamente, 0,0026 e 0,0035 nmol Pi/min/mg). Em relação à hidrólise do ADP, os grupos BC, MC e AC também apresentaram atividade da E-NTPDase mais elevada (respectivamente 0,0094; 0,0088 e 0,0083 nmol Pi/min/mg prot; P<0,001) do que o Ctrl D0 (0,0008 nmol Pi/min/mg) ou mesmo o Ctrl 5D (0,0006 nmol Pi/min/mg).

O evento da agregação plaquetária envolve componentes do Sistema Purinérgico, como quando o ADP (agonista purinérgico) estimula os receptores P2Y1 e P2Y12 (receptores purinérgicos). A E-NTDPase, enzima purinérgica presente na membrana das plaquetas, pode controlar os níveis extracelulares de moléculas como ADP e ATP, e dessa forma, alterar a resposta das plaquetas ao estímulo de ADP endógeno. A atividade elevada da E-NTPDase ao hidrolisar o ADP em CPRCH, aproximadamente 10 vezes superior a dos controles, pode implicar na diminuição da funcionalidade dessas plaquetas. Assim, apesar da transfusão e do aumento da contagem de plaquetas no paciente, a função delas pode estar prejudicada, implicando no controle da hemostasia.

Os CPRCH testados neste estudo têm uma contaminação suficiente para que fossem considerados impróprios para transfusão (inclusive pelo risco de aloimunização a antígenos eritrocitários), mas é importante continuar a investigação com CPs com menores graus de contaminação em razão do potencial prejuízo do controle da agregação plaquetária pela via ADP dependente.