Células T-CAR são eficazes no tratamento de neoplasias de células B. No entanto, em casos como de leucemia linfocítica crônica, a eficácia ainda é limitada, destacando a necessidade de aumentar a eficiência destas células. Alguns trabalhos demonstram que a polarização de células T-CAR ao fenótipo Th17 aumenta a lise tumoral contra melanoma e câncer de pulmão. No entanto, a polarização para Th17 envolve o uso de citocinas e anticorpos neutralizantes que elevam o custo de produção. O fenótipo Th17 também é dependente da expressão do fator de transcrição RORγt cuja superexpressão em células de camundongos é suficiente para induzir Th17. Portanto, o objetivo deste trabalho foi de produzir células T CD4 CAR com fenótipo Th17 através da expressão ectópica de RORγt e testar o potencial antitumoral in vitro e in vivo.

Clonamos dois vetores lentivirais que codificam o CAR anti-CD19 (vetor CAR) e, em um deles, adicionamos RORγt para produzir células rTh17-CAR. Em paralelo, estabelecemos um protocolo de polarização à Th17 com o coquetel de citocinas e anticorpos rhIL-6, rhIL-1β, rhIL-23, αIFN-γ, e αIL-4 (células cTh17) e testamos a adição de um agonista de RORγt. Após a polarização, fizemos qPCR para avaliar a expressão dos genes RORC2 e IL-17A. Transduzimos células cTh17, CD4 e CD8 com os vetores e misturamos 1 CD4:1 CD8 para as análises funcionais. Fizemos cocultivo com células Rajiluc e a citotoxicidade foi mensurada pela quantificação da bioluminescência (sistema IVIS Lumina). Durante o cocultivo, quantificamos a secreção de IL-17 e IFN-γ por ELISA. Na análise de citotoxicidade in vivo infundimos 5 × 105 Rajiluc por via intravenosa em camundongos NSG. Após 6 dias da indução da doença, tratamos os animais com 2 × 106 T-CAR. A progressão tumoral foi mensurada periodicamente pela quantificação da bioluminescência.

A presença do agonista de RORγt aumentou a expressão de IL-17A em 45%, embora não influenciou na expressão de RORC2. Portanto, utilizamos o agonista para produção das cTh17. Após a padronização do protocolo, produzimos células cTh17-CAR, CD4-CAR e CD8-CAR e fizemos o cocultivo, que resultou em alta lise tumoral pelas células T-CAR. Na análise de ELISA, as células cTh17-CAR+CD8-CAR secretaram mais IFNγ que as CD4-CAR+CD8-CAR e rTh17-CAR+CD8-CAR. Já a secreção de IL-17 foi de 1000 e 2000 pg/mL/24h pelas rTh17-CAR+CD8-CAR e cTh17-CAR+CD8-CAR, respectivamente. A análise de citotoxicidade in vivo resultou na similaridade no efeito citotóxico entre os grupos analisados.

Assim como em linfoma de Burkitt, as Th17 são citotóxicas in vitro contra câncer de pulmão e melanoma. Nestes casos, as Th17-CAR foram superiores às T-CAR convencionais devido à menor expressão de PD-1 e TIM-3. A menor secreção de IL-17 pelas rTh17-CAR+CD8-CAR, pode ser explicada porque a diferenciação para Th17 é dependente de vias como STAT-3, que é upstream à RORγt. Já o resultado obtido na análise in vivo pode estar relacionado ao modelo tumoral utilizado.

Células Th17-CAR não possuem maior potencial antitumoral em relação às T-CAR convencionais em modelo de linfoma de Burkitt. No entanto, desenvolvemos um método simplificado de produção de células com perfil associado à Th17, cuja eficácia superior já foi demonstrada em outros tipos de tumores.