Recentemente, a reação em cadeia da polimerase digital (dPCR) surgiu  como um método sensível, rápido e de custo efetivo para detectar diferentes marcadores tumorais de baixa frequência alélica. Este estudo teve como objetivo padronizar e validar um teste para detecção da mutação D816V do gene KIT em pacientes com suspeita de mastocitose sistêmica (MS) por dPCR na rotina laboratorial.

Foram utilizadas amostras de DNA genômico extraídas do sangue periférico de 17 pacientes com suspeita de MS com o kit QIAamp® DNA Blood Midi Kit. A pesquisa da mutação D816V do gene KIT foi realizada pelo sequenciamento clássico de Sanger, utilizando-se o reagente BigDye Terminator v3.1™em equipamento ABI3500 e  pela técnica de dPCR, na plataforma QuantStudio 3D e utilizando-se o ensaio Taqman LiqBiopsy Digital Hs0000000039_rm. As amostras foram testadas em duplicatas e quando a frequência alélica estava próxima de 0,1%, em triplicatas.

Pelo método do sequenciamento de Sanger a mutação D816V foi detectada em apenas uma amostra. Já pela técnica da dPCR, a mutação foi detectada em 14 amostras, sendo que a média da frequência alélica foi de 2,1%  (0,15% – 6,79%), sendo que houve boa concordância entre as replicadas. Das 4 amostras testadas em triplicatas, a presença da mutação foi confirmada em 2, com uma frequência alélica média de 0,15%  (0,14% - 0,16%).

A MS tem origem na proliferação clonal de mastócitos anormais em órgãos extra-cutâneos. A apresentação clínica da MS é heterogênea, variando da doença indolente até uma variante mais agressiva. Atualmente, a Organização Mundial da Saúde classifica a mastocitose como uma categoria distinta de doença e mutações do gene KIT, particularmente a mutação D816V ocorre em quase todos os casos, independentemente do subtipo, sendo, desta forma, um marcador importante para o diagnóstico da doença, além de alvo terapêutico. O dPCR se mostrou uma técnica sensível, frente ao sequenciamento de Sanger, capaz de detectar a mutação D816V em sangue periférico, descartando assim a necessidade de punção medular. Além disso, proporciona a quantificação absoluta da frequência alélica da mutação, com boa concordância entre as replicatas, o que é importante para a estratificação de risco. O protocolo é rápido, com possibilidade de liberar o resultado em até 5 dias, sendo que a montagem dos chips utilizados e a análise são as etapas mais trabalhosas. O custo do teste também é efetivo, especialmente quando comparado com outras técnicas de sensibilidade semelhante, como o NGS. Uma limitação encontrada é que nesta técnica a reação é específica para cada mutação, não abrangendo desta forma as demais mutações do gene KIT, como V560G, D815K, D816Y, D816F, D816H e D820G que também podem ser encontradas na MS em cerca de 5% dos casos, o que pode explicar os 2 casos negativos encontrados.