A leucemia mieloide aguda (LMA) é uma neoplasia maligna do tecido hematopoiético, na qual células precursoras da linhagem mieloide adquirem uma série de mutações que bloqueiam seus programas de diferenciação e maturação. A etiologia da doença está associada a uma paisagem genômica altamente heterogênea, na qual alterações nos genes FLT3 e NPM1 destacam-se por seu impacto no prognóstico clínico. Mutações nestes genes são identificadas em 25% e 33% dos pacientes com LMA e parecem atuar sinergicamente na manutenção do estado leucêmico. Em 2019, um grupo de pesquisadores propôs que a enzima desoxinucleotidil-transferase terminal (TdT) fosse responsável pela formação de pequenas inserções ou duplicações nos genes FLT3 (FLT3-ITD) e NPM1 (NPM1c). Essas alterações estão associadas a outras mutações pré-existentes nas células, em especial as que afetam o gene DNMT3A. Como essa DNA metiltransferase pode regular a expressão gênica na célula, nós buscamos investigar se mutações em DNMT3A podem contribuir para a desregulação da expressão de TdT e, com isso, facilitar a ocorrência de mutações em FLT3 e NPM1 na patogênese molecular da LMA. MATERIAL E

Amostras de medula óssea e ou sangue periférico de pacientes diagnosticados com LMA foram utilizadas para a obtenção de DNA e RNA. As regiões com maior incidência de inserções nos genes FLT3 (éxon 14), NPM1 (éxon 12) e mutação em DNMT3A (éxons 19 e 23) foram amplificadas por PCR. As microinserções em NPM1 e FLT3 foram identificadas por análise de fragmentos e sequenciadas nos casos positivos. Mutações pontuais em DNMT3A foram identificadas por Sequenciamento de Sanger. RESULTADOS: Nossa casuística atual inclui 66 pacientes, dos quais 61% possuem idade pediátrica (0 a 18 anos). A proporção de pacientes com sexo feminino e masculino está semelhante (47% e 53%, respectivamente) e 15% apresentaram a forma promielocítica da doença (LMA-M3). Mutações em FLT3 e NPM1 foram identificadas em 15% e 18% dos casos, respectivamente. Quanto à classificação de risco prognóstico proposta pelo grupo European LeukemiaNet, 15% dos pacientes foram classificados com risco favorável, 84% com risco intermediário e 2% com risco adverso. O tamanho médio das inserções em FLT3 foi de 54 pares de bases, enquanto que as microinserções em NPM1 tiveram apenas 4 pares de bases. A mutação do tipo A (c.860_863dupTCTG) foi a mais observada no gene NPM1, correspondendo a 56% das mutações neste gene. Até o momento, rastreamos mutações no éxon 19 de DNMT3A em 21 pacientes, sendo que um deles apresentou uma mutação pontual no resíduo 735 (c.735TAC>TCC), que leva a uma substituição do resíduo de aminoácido tirosina por serina.

A frequência de mutações em NPM1 e FLT3 verificada foi semelhante ao que vem sendo relatado na literatura. No momento, iniciamos a identificação de mutações no éxon 19 de DNMT3A e, ao longo do projeto, pretendemos investigar também a presença de mutações no éxon 23 de DNMT3A. Além disso, já padronizamos e iniciaremos a avaliação dos níveis de expressão gênica de DNTT por RT-qPCR, a fim de associá-los a presença de mutações em FLT3, NPM1 e DNMT3A.