Nosso grupo tem trabalhado no desenvolvimento de células NK-CAR com construção inovadora para cânceres hematológicos, CD19, e sólidos, GD2 e MAGE-A4 em parceria com o Dr. Hiroshi Shiku. Os vetores CAR para CD19 GD2 co-expressam a molécula GITRL e o MAGE-A4 contém o domínio intracelular do receptor GITR. O objetivo deste estudo é estabelecer a produção de células NK-CAR contra diferentes alvos de tumores hematológicos e sólidos utilizando células NK-92 e NK primárias de sangue periférico de doador saudável. Também buscamos otimizar a expansão de NKs do sangue periférico através do uso de células feeders Para a produção de células CAR-NK é utilizado vetor lentiviral SEW com o promotor SFFV e para a otimização da transdução de SEW em células NK-92 foram testadas diferentes concentrações de polibreno e BX795. A partir da determinação das melhores condições de transdução, foram geradas células CAR-NK anti-CD19, anti-GD2-GITRL, anti-GD2 e anti-MAGEA4. A eficiência de transdução de cada CAR foi determinada por citometria de fluxo. Paralelamente, foi realizado isolamento de NK proveniente de sangue periférico de doador saudável e cultivo in vitro utilizando meio suplementado com soro AB e IL-2. Três linhagens de K562 foram utilizadas como feeders expressando 4-1BBL, IL-15mb ou 4-1BBL+IL-15mb, as quais foram previamente tratadas com mitomicina C para inibição do crescimento. Durante o cultivo foram analisados crescimento e viabilidade celular e a presença de células NK foi confirmada por citometria de fluxo. A ação de cada feeder sobre o crescimento das células NK foi acompanhada durante 9 dias. No processo de otimização da transdução das células NK-92 foram avaliados viabilidade dos cultivos e eficiência de transdução e a melhor condição obtida foi 8 ug/mL de polibreno, 16uM de BX795 e spinoculação durante 60 minutos. Utilizando este protocolo a eficiência de transdução do vetor anti-CD19 foi de 30%, anti-MAGE-A4-GITR 51,3%, anti-GD2 10,3% e anti-GD2-GITRL 8,69%. Posteriormente nos experimentos com NK primária foram inoculadas 1 × 105 células NK e ao fim do cultivo a quantidade de células NK (CD56+) em todos os cultivos foi maior que 94%. Em relação ao crescimento celular, os números foram 3 × 106 quando cocultivada com a feeder IL-15mb, 7 × 106 com a 4-1BBL e 1 × 107 com a feeder 4-1BBL+IL-15mb. A porcentagem de células NK observadas por citometria indica que as feeders são eliminadas ao longo dos dias e apenas oferecem suporte à expansão das células NK. Entre as feeders utilizadas, foi observado crescimento mais pronunciado com o uso da K562-41BBL-IL15mb, apresentando um aumento de 116 vezes. Através do protocolo otimizado de transdução foi possível produzir NK-CAR com todos os vetores testados e os resultados de cocultivo com feeders obtidos até o momento permitem a expansão de células NK de sangue periférico para a produção de células NK-CAR. Os próximos passos envolvem a transdução dos vetores anti-CD19-GITRL e anti-CD19-noGITRL, seleção de células CAR e ensaios de citotoxicidade in vitro dos diferentes alvos.