A presença de mutações no gene TP53 é fator prognóstico em leucemia mieloide aguda (LMA) e, apesar de serem encontradas em baixa frequência, mecanismos adicionais de inativação da via de sinalização de p53 são encontrados em todos os pacientes. A proteína p21, alvo de p53, é conhecida como regulador do ciclo celular, podendo exercer outros papéis, assumindo caráter supressor tumoral ou oncogênico a depender da sua localização subcelular. Devido ao seu papel central, a regulação da via de p53 é complexa e evidências apontam para a participação das pequenas GTPases RHOA e RHOC. Porém, a relação entre as vias de sinalização de p53/p21 e RHOA/C nunca foi avaliada em células mieloides.

Avaliar os efeitos do silenciamento de RHOA ou RHOC na expressão e localização subcelular de p53 e p21 em células mieloides irradiadas com UVC.

Linhagem mieloide OCI-AML3 (TP53 selvagem) e U937 (TP53 mutado) foram estavelmente transduzidas com lentivírus para silenciamento de RHOA (shRHOA) ou RHOC (shRHOC). Lentivírus contendo shRNA inespecífico foram utilizados como controle (shCTRL). O silenciamento foi confirmado por western blot. A expressão de p53 foi induzida através de irradiação com UVC. As células foram analisadas por western blot e microscopia confocal de imunofluorescência após 2-24hs de exposição à UVC. A expressão de p53 foi também avaliada por citometria de fluxo. A colocalização entre p53/p21 e o núcleo celular (DAPI) foi analisada nas imagens de microscopia com o software CellProfiler™ e quantificada por correlação de Pearson.

Células shRHOA ou shRHOC apresentaram redução de mais de 70% de expressão nas respectivas proteínas em comparação as células shCTRL. Interessantemente, o silenciamento de RHOA, por si, induziu a expressão de p53 em OCI-AML3 e de p21 em ambas linhagens. Em células OCI-AML3, a irradiação com UVC induziu a expressão de p53 nas primeiras horas após exposição, com posterior redução. O tempo de 4 horas após irradiação foi escolhido para os experimentos seguintes. Células OCI-AML3 shRHOA e shRHOC também apresentaram aumento de p53 após irradiação. Células shRHOA apresentaram p53 mais citoplasmática em comparação as células controle (p < 0,05), enquanto células shRHOC apresentaram p53 aberrantemente mais nuclear (p < 0,05). Este mesmo perfil foi observado em p21. Conforme esperado, houve deslocamento de p53 e de p21 para o núcleo após irradiação nas células controle. Porém, houve falha nas células shRHOA e RHOC no deslocamento nuclear de ambas as proteínas. Células U937 apresentaram distribuição de p21 mais aleatória em comparação às OCI-AML3. O silenciamento de RHOA em U937 não alterou significativamente esse padrão. Após UVC, observamos tendência à redistribuição citoplasmática em shRHOA (p < 0,0001).

O aumento da expressão de p53 em células silenciadas para RHOA converge com o papel oncogênico atribuído a essa RHO GTPase. Apesar do aumento nos níveis de p53, sua atividade parece estar comprometida, evidenciado pela menor translocação nuclear após estresse genotóxico. Por outro lado, o silenciamento de RHOC resultou em acúmulo aberrante de p53 no núcleo. A p21 exibiu o mesmo perfil. Ademais, o status de TP53 influencia na localização subcelular de p21: a deleção de p53 culminou em maior potencial oncogênico de p21. Esses achados indicam que RHOA e RHOC participam da regulação da via de p53 e, apesar da alta homologia estrutural, exercem funções distintas nesse processo.

CNPq e FAPESP.