Células dendríticas (DCs) são obtidas in vitro através da diferenciação de monócitos do sangue periférico juntamente com agentes estimulantes para sua maturação. Estudos anteriores mostraram a maturação de DCs pelo BCG vivo, porém, para modelos que visam o uso de BCG em pacientes imunossuprimidos, a maturação de DCs por BCG morto precisa ser melhor investigada. Neste trabalho avaliamos as características funcionais e fenotípicas das DCs diferenciadas in vitro a partir de monócitos humanos e estimuladas pelo BCG morto.

As DCs foram obtidas a partir do isolamento de monócitos do sangue de 4 doadores saudáveis. Após a etapa de isolamento, os monócitos foram cultivados por 5 dias com meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino, IL-4 e GM-CSF para diferenciação em DCs imaturas. Para a maturação terminal (no 5°dia) foi adicionado TNF-α e IFN-α (DC-TNF) e BCG morto (DC-BCG) na proporção de 1:1. No 6°dia, as DC-TNF e DC-BCG foram cocultivadas com os linfócitos autólogos e alogênicos previamente corados com o fluorocromo CFSE, este cultivo teve a duração de 5 dias. Para caracterizar fenotipicamente as DCs, após a maturação terminal das mesmas, os seguintes marcadores foram utilizados: CD86, HLA-DR, CD1A, PD1, CD40 e CD80. A cepa utilizada foi a Moreau-RJ liofilizada e o bacilo foi morto por radiação gama.

As culturas de DC-TNF e DC-BCG apresentaram altas taxas de células expressando o HLA-DR: 99% e 98%; CD1A: 62% e 57% e CD86: 97% e 98%, respectivamente. A taxa celular de expressão de CD80 foi baixa em culturas de DC-TNF: 14%, em culturas de DC-BCG: 11%. A taxa de células expressando CD40: em DC-TNF: 0,80%, em DC-BCG: 1,83% e o marcador PD-1 em DC-TNF: 17%, em DC-BCG: 17%. Porém, os valores percentuais da expressão desses marcadores, não foram significativamente diferentes. Os níveis de MFI (média de intensidade de fluorescência) em HLA-DR foram altos em DC-TNF e DC-BCG: 8.339 e 7.245, respectivamente. Os níveis de expressão de CD86 também foram altos, sendo DC-TNF: 11.685 e DC-BCG: 10.942. Os níveis de MFI do CD1A foram altos, tanto para DC-TNF, quanto para DC-BCG: 5.100(1.596-9.46) e 5.947(2.638-10.483), respectivamente, e para este marcador confirmamos diferença significativa (p<0,05). As DC-TNF e DC-BCG tiveram MFI para PD-1: 4.008 e 3.177; e CD40: 1.135 e 976, respectivamente. Já os níveis de MFI para o CD80 foram sempre baixos, DC-TNF:663 e DC-BCG: 612. Na proliferação linfocitária observamos que existe maior estímulo por DC-BCG, tanto na proliferação autóloga, como na proliferação alogênica. DC-BCG apresentou maior proliferação linfocitária autóloga: 13% (2-24%) e alogênica 23% (16-35%), enquanto que as células DC-TNF: na autóloga 8%(2-19%), e alogênica 18%(11-32%).

O uso de BCG morto promove maturação de DCs em níveis equivalentes ao TNF. Mas, o BCG potencializa a proliferação linfocitária em maior taxa que o TNF. Estudo da produção de citocinas em quantidade e qualidade serão objeto de estudo para interpretar os resultados obtidos.

Na análise do fenótipo das células DCs-TNF e DC-BCG não observamos diferença significativa para os marcadores HLA-DR, CD86, CD80, PD-1, CD1A e CD40, porém, observamos taxa mais elevada na MFI no CD1a das DC-BCG. A indução de proliferação linfocitária foi maior para DC-BCG do que DC-TNF.