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Vol. 42. Issue S2.
Pages 508-509 (November 2020)
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Vol. 42. Issue S2.
Pages 508-509 (November 2020)
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ESTABELECIMENTO DE PROTOCOLOS PARA DIFERENCIAÇÃO ERITROIDE UTILIZANDO CÉLULAS-TRONCO PLURIPOTENTES INDUZIDAS (IPSC) DERIVADAS DE PACIENTES COM ANEMIA FALCIFORME (AF)
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G.L.S. Martinsa,b, B.D. Paredesb,c, B.S.F. Souzaa,b,c, C.K.V. Nonakab, L.S.A. Françab,c,d
a Instituto Gonçalo Moniz, Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Salvador, BA, Brasil
b Centro de Biotecnologia e Terapia celular, Hospital São Rafael, Salvador, BA, Brasil
c Instituto D’Or de Pesquisa e Ensino (IDOR), Rio de Janeiro, RJ, Brasil
d Programa de Pós-Graduação em Imunologia (PPGIm), Universidade Federal da Bahia (UFBA), Salvador, BA, Brasil
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Objetivo: Estabelecer um protocolo para obtenção de células eritroides a partir de iPSC derivadas de indivíduos com AF, de modo a obter um modelo experimental in vitro para desenvolvimento de novas terapias. Material e métodos: Linhagens de iPSC foram previamente geradas e obtidas de doador saudável (CBTCi003) e paciente com AF (CBTCi006). A determinação do haplótipo do gene βS foi realizada pela análise de polimorfismo do fragmento de restrição utilizando a reação em cadeia da polimerase. As duas linhagens foram submetidas ao estabelecimento de um protocolo de diferenciação eritroide em etapas: i. obtenção de células progenitoras hematopoiéticas (HPCs), pela formação de corpos embrioides (EBs); ii. expansão de eritroblastos; e iii. maturação final. Etapas confirmadas por citometro de fluxo para os marcadores CD34, CD43, CD45, CD71, CD36 e CD235a. Foi realizado ensaio de célula formadora de colônia (CFC) utilizando meio específico Methocult. A morfologia das células nas etapas ii e iii foi identificada com coloração giemsa após cito centrifugação. Foi feita uma avaliação da produção de hemoglobina fetal (HbF) e hemoglobina β (HbB), pela reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa (RT-qPCR), utilizando sonda para o gene HBG2 e HBB, respectivamente. Resultados: O haplótipo da linhagem CBTCi006 foi identificado Benin/Benin. HPCs presentes no sobrenadante, obtidas pela agregação com placa de fundo em U não aderente, apresentaram marcação de 40% e 56% de células CD34+ para as linhagens CBTCi003 e CBTCi006, respectivamente. Já a marcação CD34+/CD45+ foi de 15% e 27% enquanto a marcação CD43+/CD45+ foi de 66% e 86%. Pelo ensaio de CFC foram identificadas colônias de diferentes tipos: BFU-E, CFU-E, CFU-GM e CFU-GEMM. Na etapa ii, o rendimento foi de 40x em relação ao número inicial de iPSC plaqueadas para formação de EBs. As células apresentaram marcação para CD36+/CD71+ de 35%. Além da caracterização por imunofenotipagem, foi observada formação de um pellet celular vermelho. A análise de HBG2 (HbF) e HBB (HbB) por RT-qPCR demonstrou a produção de HBG2 aumentada nas células derivadas de iPSC quando comparadas a uma amostra obtida de sangue periférico (SP), no entanto, o contrário foi observado para o gene HBB. Foi possível ainda observar marcação de 52% de células CD71+/CD235a+, e a presença de proeritroblastos e eritroblastos ortocromáticos. Discussão: A presença das HPCs no sobrenadante indica que essas células emergem dos EBs para a o meio em suspensão. As HPCs apresentam marcação positiva para CD34/CD45 importante para identificação desse tipo celular, assim como o CD43, também expresso, importante para o início da diferenciação eritroide in vitro. A capacidade de proliferação e diferenciação das HPCs foi comprovada pela obtenção de diferentes tipos de colônias. Eritroblastos da etapa ii expressavam CD36+/CD71+. Ao final, a visualização do pellet vermelho indicou produção de hemoglobina, confirmando a diferenciação em células eritroides também pela expressão de CD71+/CD235a+. Embora sejam observados os marcadores de células maduras, a análise de RT-qPCR identificou expressão com perfil fetal, já que níveis de HBG2 estavam elevados. Conclusão: Foi possível estabelecer um protocolo de geração de células eritroides a partir de iPSC de indivíduos com AF que permite a sua utilização para testes farmacológicos e estudos de mecanismos da doença.

Idiomas
Hematology, Transfusion and Cell Therapy

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